1. 将制胶架放在一个水平的桌面上,然后将凝胶托盘放到制胶架中相应的格子里,之后再 放梳子于狭槽里。根据需要,制胶架可以制作 13×13cm, 13×6.5cm,6.5×13cm, 6.5×6.5cm 四 种规格的凝胶。 2.根据被分离 DNA 片段的大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶液:应准确称量琼脂糖 干粉将其加入到盛有已定量电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中,用玻璃棒搅拌均匀后放入沸水 浴或微波炉中加热至琼脂糖熔化。(琼脂糖凝胶浓度选择见附表) 3.待凝胶稍微冷却后,缓慢倒入凝胶托盘中,胶厚度以 3~5mm 为宜(注意:胶内不能有 气泡)。 4.让凝胶溶液完全凝结,室温下 30~45min(待胶略凝结时,也可以放入 4℃冰箱,可大大 缩短凝结时间)。小心拔出梳子,将凝胶安放到电泳槽内,加样孔一侧靠近阴极(黑色末端)。 5.向电泳槽内加入电泳缓冲液,至少没过凝胶 2mm。(注意:TAE 缓冲液,一般用 2~3 次就要更换,TBE 缓冲液则可使用 10 次左右。) 6.取适量的 DNA 样品与 10×加样缓冲液混合(分析单一 DNA 样品,如 L 噬菌体或质粒 DNA,每个 5mm 宽加样孔可加 100~500ng DNA。如果样品由不同大小的许多 DNA 片段组成, 如哺乳动物 DNA 酶切样品,则每个加样孔加入 20~30μg 的 DNA 也不会造成分辨率明显下 降),然后用移液枪将样品加入样品孔内。一定要包含合适的 DNA 分子量标准物,将其分别加 至样品孔的左侧和右侧孔中。 7.加样完毕后,盖上电泳槽上盖,连接电泳仪电源。给予 5~8V/cm 的电压,其中距离以 阳极至阴极之间的测量为准。阳极和阴极由于电解作用将产生气泡。DNA 应向阳极(红色插头) 侧泳动。电泳时间的选择取决于胶的长度、电压和 DNA 片段的大小。胶越长,电压越低,DNA 片段越大,所需时间就越长。然而使用高压时,大的 DNA 片段的分辨率很低,电泳出的条带 不清晰。(每厘米凝胶电压不超过 8V,若电压过高分辨率会降低,只有在低电压时,线性 DNA 分子的电泳迁移率与所用电压成正比。) 8.当指示剂迁移到凝胶底部时,关上电源并取出样品放入事先配好的 EB 溶液中染色 5~ 10min(EB 见光分解,应置于暗室中),在紫外透射仪上观察并可用数码相机进行拍摄(也可在 制胶时将 EB 加入到凝胶中)