北京六一  电泳仪 DYY-6C  DYCP-31DN
当前位置:首页 > 毛细管电泳法表征多肽及糖蛋白的稳定性

毛细管电泳法表征多肽及糖蛋白的稳定性

[导读]建立了毛细管电泳表征多肽和糖蛋白稳定性的方法。分别以血管紧张素 II( Ang II) 和植物血球凝集素 ( PHA) 、牛凝血酶( B-Thr) 、人凝血酶( H-Thr) 、辣根过氧化物酶( HRP) 4 种糖蛋白为多肽和糖蛋白的模式分子。

定量蛋白质组学的绝对定量方法需要使用标准 内标肽,内标肽的纯度和稳定性等性质影响定量方 法的准确度和精确度。同时,蛋白质定量方法研究 中也需要保证蛋白质样品的性质稳定和一致。由于 多肽及蛋白质的不稳定性在很大程度上影响蛋白质的定量研究,因此快速、有效地评价和表征样品的稳 定性是定量蛋白质组学深入研究应该解决的问题之 一,样品稳定性也是定量蛋白质组学研究必须关注 的基本内容。 血管紧张素 II 是人体内重要的体液调节物质,对心血管功能稳定、电解质和体液平衡的维持、血压 调节等方面均有重要作用[1]。血管紧张素 II 作为 标准内标肽和药用多肽时,其纯度、稳定性是质量优 劣的关键指标。血管紧张素 II 的检测多采用高效 液相色谱( HPLC) 结合免疫化学方法[2]或放射性同 位素检测[3]。也有基于高效液相色谱法研究物理 和化学因素( 如保存条件、温度、 pH 值、缓冲溶液) 对多肽稳定性的影响[4]。相比 HPLC,毛细管电泳 ( CE) 方法速度快,分辨率高,所需样品量少,已有多 肽药物[5]和生物样品中血管紧张素及衍生物的分 析报道[6],与毛细管电泳相关的毛细管电泳-质谱联 用( CE-MS)[7 -9]、毛细管电色谱( CEC)[10]方法也出 现在一些多肽的分析中。 糖蛋白是生物体内重要的功能蛋白,也是修饰 蛋白质组学的研究热点。作为定量蛋白质组学研究 的基础,了解糖蛋白的稳定性是其相关研究的基础 和前提。目前糖蛋白稳定性的研究重点主要是利用 分子动力学模拟和物理化学参数变化研究其结构稳 定性[11 -13]。也有基于紫外光谱法针对特定生物体 内所提取的蛋白质的含量变化进行稳定性表征的研 究报道[14]。利用毛细管电泳分析与糖有关的糖蛋 白、寡糖和糖肽已有综述报道[15, 16] 。 多肽和糖蛋白大多具有生物学活性,外界条件 变化易于影响多肽和糖蛋白的结构,引起稳定性改 变和分子的荷质比变化。毛细管电泳法可快速表征 多肽和糖蛋白的分子的荷质比差异。在不同的外界 条件下( 如样品存放时间、温度、溶液 pH) ,多肽和 糖蛋白的电泳图谱的出峰个数、出峰时间以及峰形 等参数可指示分子的表面电荷性质甚至分子结构的 变化,从而可用于表征多肽和糖蛋白的稳定性。尽 管已有较多针对多肽和糖蛋白的相关分析报道,但 针对两类样品稳定性和影响因素的研究还没有较系 统的报道。本文以市售血管紧张素 II 和植物血球 凝集素、牛凝血酶、人凝血酶、辣根过氧化物酶4 种 糖蛋白为多肽和糖蛋白模式分子,利用毛细管电泳 分析方法表征其稳定性。

1 实验部分

1. 1 仪器与试剂 Beckman P/ACE MDQ 毛细管电泳系统,配备紫 外( UV) 检测器( 美国 Beckman Coulter 公司) 。Agilent 7100 毛细管电泳系统,配备二极管阵列检测器 ( DAD 检测器) ( 美国 Agilent 公司) 。 血管紧张素 II( Ang II) 是人工合成的 DRVYIHPF 八肽, pI 6. 94,纯度≥95%,购自上海强耀生物科技有限公司。植物血球凝集素( PHA,pI 5. 4 ~ 6. 5) 、牛凝血酶( B-Thr,pI 5 ~8) 购自 Sigma Aldrich 公司,人凝血酶( H-Thr,pI 5 ~8) 购自 Enzo Life Sciences 公司,辣根过氧化物酶( HRP,pI 3 ~ 9) 购自 ROCHE 公司。 硼酸、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、柠檬酸和柠檬酸 钠( 北京化工厂) ,硼砂和磷酸氢二钠( 国药集团化 学试剂有限公司) ,磷酸氢二钠( 北京化学试剂公 司) ,Tris( 北京拜尔迪生物技术有限公司) ,上述试 剂均为分析纯,实验用水均为蒸馏水。 熔融石英毛细管购自凯利奥拉色谱分析( 邯 郸) 有限责任公司。涂层毛细管购自河北邯郸开发 区奥泰克生物科技有限公司。

1. 2 毛细管电泳实验条件 多肽分析条件: Beckman P/ACE MDQ 毛细管电 泳系统,进样压力3. 45 kPa( 0. 5 psi) ,进样时间5 s; 正向20 kV 分离,检测波长为 280 nm; 样品溶液用 稀释后的电泳缓冲液配制。熔融石英毛细管( 有效 长度/总长: 40 cm/50. 2 cm,内径: 75 μm) ,两次实 验间和实验结束后,依次用0. 1 mol/L NaOH 和H2O 在172. 37 kPa ( 25 psi) 下冲洗 5 min。毛细管不用 时需将两端水封后置于室温下保存。 糖蛋白分析条件: Agilent 7100 毛细管电泳系 统,进样压力 5 kPa,进样时间 5 s; B-Thr 的分析电 压为 -10 kV,其余3 种糖蛋白均为 -20 kV;检测波 长为195 nm; 样品溶液用 0. 2 mol/L( pH 7. 4) 硼酸 盐缓冲液配制。涂层毛细管( 有效长度/总长: 25 cm/33. 5 cm,内径:75 μm) ,新毛细管在使用前分别 用20 mmol/L H3PO4 和 H2O 各冲洗10 min,两次实 验之间和实验结束后,依次用 20 mmol/L H3PO4 和 H2O 冲洗5 min,毛细管不用时需将两端水封后置于 4 ℃冰箱中保存。

2 结果与讨论 对人工合成的 Ang II 进行纯度和稳定性分析。 优化样品分析所需样品浓度、电泳缓冲液、样品溶液 pH 和离子强度等条件,并对样品的纯度进行表征, 对保存温度和时间对样品溶液稳定性的影响进行讨 论。分别考察了 PHA、 B-Thr、 H-Thr 和 HRP 这 4 种 糖蛋白在毛细管中的吸附性,在电泳中的荷电性质 及迁移,以及保存温度和时间对 4 种糖蛋白样品溶 液稳定性的影响。

2. 1 Ang II 分析

2. 1. 1 样品浓度选择准确称取 Ang II 样品溶于水中,配制成 60 g/L 的母液,实验时稀释到所需浓度。考察样品浓度与 峰面积之间的线性关系,如图1 所示, Ang II 在0. 03 ~0. 24 g/L 质量浓度范围内线性关系良好。后续 实验中所用质量浓度均为 0. 06 g/L,该浓度下样品 的吸收值可满足对样品峰的观察和对比。图 2 ( a) 缓冲液种类、 ( b) 硼酸盐缓冲液的 pH、 ( c) 样品溶液的 pH 和( d) 样品溶液中离子强度对分离的影响 Fig. 2 Effects of ( a) buffer type,( b) buffer pH,as well as ( c) pH and ( d) ionic strength of Ang II sample solution on separation

2. 1. 2 电泳缓冲液对分离的影响 电泳缓冲液种类和 pH 是决定分离效果的关键 因素之一。实验中考察了 5 种不同的缓冲体系: 硼 酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、 PBS 缓冲液、磷酸氢二 钠-柠檬酸缓冲液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液( 配比 见表1) 对样品分析的影响( 如图2a) 。 不同缓冲体系导致 AngⅡ的迁移差异及负峰的 出现。比较电泳图中样品峰的峰高和峰形,发现使 用硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、 PBS缓冲液和磷

酸氢二钠-柠檬酸缓冲液时,样品峰的峰形尖锐,峰 高值大。而含有磷酸盐的后3 者缓冲体系的电流值 明显高于硼酸盐缓冲体系,故后续实验选择硼酸盐 缓冲液为电泳缓冲液。考察了不同 pH 的缓冲液对

目标峰和杂质峰的灵敏度和分离度的影响( 图2b) , 可见pH 为8. 7 和9. 0 时杂质峰的检测最灵敏,且与 目标峰分离度较好,对目标物的检测干扰最小,因此 后续实验选择 pH 9. 0 的电泳缓冲液。

2. 1. 3 样品溶液 pH 和离子强度对分离的影响 电泳过程中,待测样品会在低电导样品溶液与 高电导电泳缓冲液的界面处发生堆积效应产生富集 作用。当电泳缓冲液保持恒定时,样品溶液的 pH 和离子强度会对目标峰与杂质峰的分离产生影响。 Moring 等[17]的研究表明,样品溶液浓度为电泳 缓冲液浓度的1/10 时,样品的浓缩效果最好。故在 pH 9. 0 硼酸盐缓冲液( 0. 2 mol/L) 为电泳缓冲液 时,以稀释的不同 pH 的硼酸盐缓冲液( 0. 02 mol/L) 配制样品溶液,考察样品溶液 pH 值对分离 的影响。结果表明,不同样品溶液 pH 导致目标峰 面积有所差异,但迁移时间以及目标峰与杂质峰的 分离度基本不变( 图2c) 。 同样,样品溶液中离子强度较低也可使样品中 组分产生更好的浓缩效果,而增加离子强度则使检 测灵敏度降低。由图2d 可见,在相同样品浓度溶液 中加入 NaCl 时, NaCl 浓度增大使样品中目标峰和 杂质峰均展宽,且峰面积降低,目标峰与杂质峰的分 离度也降低。说明对样品进行纯度分析时,样品溶 液中的离子强度或盐浓度较大不利于提高目标峰和 杂质峰的分离度,实际样品的纯度检测应在低盐条 件( <50 mmol/L NaCl) 下进行。 综合考虑上述影响因素,保持目标峰与杂质峰 的分离度最好,且目标峰检测灵敏度高的优化条件 为:以0. 2 mol/L 硼酸盐缓冲液( pH 8. 7 或 9. 0) 为 电泳缓冲液,以稀释 10 倍的电泳缓冲液( 0. 02 mol/L) 配制样品。 2. 1. 4 样品的纯度分析 考虑到实验中电渗流和实验条件的波动对峰面 积值的影响,以目标峰和杂质峰的峰面积及校正的 峰面积( 峰面积/迁移时间) 表示目标峰和杂质峰的 量。利用峰面积归一化法,分别以目标峰面积与总 峰面积、校正的目标峰面积与总校正峰面积的比值 表示样品的相对纯度。

对0. 06 g/L 的 Ang II 重复测定3 次,测得样品 的纯度值分别为:91. 40% /88. 76%( 峰面积比值/校 正峰面积比值) 、89. 09% /89. 37% 和 90. 83% / 91. 08%。两种计算方法测得样品纯度的平均值分 别为90. 44%( RSD 1. 09%) 和89. 74%( RSD 1. 09% ) ,两种方法之间存在约0. 7% 的数值差异,说明本 实验中的实验条件稳定,实验重复性较好。但所测 结果与商品供货商标示的纯度( ≥95%) 有明显差 异。因供货商提供的验证报告结果为 HPLC 分析图 的峰面积归一化处理所得,说明毛细管电泳方法与 HPLC 的测定结果表示的纯度值存在的差异约在 4. 56%~5. 26%之间。

2. 1. 5 存储溶液 pH 和存储温度对稳定性的影响 使用0. 02 mol/L 的 pH 7. 4 的硼酸盐缓冲液配 制 Ang II 样品,将配好的样品分为3 份,分别置于 20 ℃、 4 ℃和 -20 ℃下保存不同时间。统计各样品 的目标峰、杂质峰的校正峰面积,比较样品测定的纯 度值变化。

由图3 可知,溶液状态的 Ang II 在不同的放置 温度下,其纯度值的变化程度不同,温度越低,纯度 值变化越小。放置温度为20 ℃时, Ang II 的纯度值 下降较快, 24 h 时已降至90%以下。而低温条件( 4℃和 -20 ℃) 下, Ang II 的纯度值变化较小,放置48 h 内,二者均保持在91%以上。4 ℃与 -20 ℃相比, 4 ℃保存时不需对样品进行反复冻融,使用更方便。 故 Ang II 样品溶液较好的保存条件为 pH 7. 4 缓冲 液中、 4 ℃下放置,该条件下, Ang II 可在 48 h 内保 持良好稳定性。

2. 2 糖蛋白分析 HRP( 40 kDa) 是植物辣根中存在的糖蛋白酶 类,是酶联免疫技术中常用的酶之一。凝血酶( 34 kDa) 是由凝血酶原形成的蛋白质水解酶,是凝血过 程中催化血纤蛋白原水解的酶。H-Thr 是通过重组 技术获得, B-Thr 是从牛血浆中提取而来。PHA ( 115 kDa) 是一类具有特异糖结合活性的糖蛋白, 通过细胞膜上特定的糖基识别可区别细胞的类型和 反映细胞在分化、成熟和肿瘤细胞性变( 性质) 中的 变化,是重要的细胞识别试剂。以上蛋白质都是生 物学中具有重要功能和应用的糖蛋白。

2. 2. 1 糖蛋白的吸附性 蛋白质通常在熔融石英毛细管内壁存在一定的 吸附性,因此考察了 4 种糖蛋白在毛细管内的吸附 性质。结果表明, 4 种糖蛋白在毛细管内壁的吸附 都很强,在电泳过程中几乎不出峰或峰形严重扭曲。 因此选择可抑制吸附的涂层毛细管进行分析。图 4 缓冲液 pH 对糖蛋白分离的影响 Fig. 4 Effect of running buffer pH on glycoprotein separation

2. 2. 2 糖蛋白的检测 因涂层管中的电渗流很弱,故所施电压主要影 响蛋白质自身的电泳迁移速率。使用硼酸盐( pH 8. 7) 电泳缓冲液,正向电压分离时, 40 min 内在负 极检测端均未检测到4 种糖蛋白。而采用负向电压 时,在正极检测端可检测到4 种糖蛋白,说明4 种蛋 白质在溶液中均表面带净负电荷。由 1. 1 节可知, 所购4 种糖蛋白样品标示的 pI 值均不是单一值,而 是处于3 ~9 之间。上述实验结果进一步说明所购

4 种蛋白质的等电点均低于8. 7。此外, H-Thr 和 HRP 电泳时出现单一峰,而 B-Thr 和 PHA 则出现多 重峰,因此认为后两者可能存在多种蛋白质的亚型 或变体结构。

2. 2. 3 分析条件优化 缓冲液的选择 考察了硼酸盐缓冲液( 0. 2 mol/L) 、磷酸盐缓冲液( 0. 2 mol/L) 和 Tris-HCl 缓冲 液( 0. 1 mol/L) 对分离的影响。Tris-HCl 缓冲液中, H-Thr、 B-Thr 以及 HRP 均不出峰, PHA 多峰间分离 度极差,只出一个包峰; 磷酸盐缓冲液中, 4 种糖蛋 白分析时基线不平,出峰杂乱,且 B-Thr 和 PHA 的 多峰之间分离度很低; 使用硼酸盐缓冲液, PHA 和 B-Thr 的多峰间分离度较高,且 H-Thr 和 HRP 的峰 形较好,响应值较高。故实验中选用硼酸盐溶液作 为电泳缓冲液。 缓冲液 pH 的选择 因涂层毛细管的内表面涂 层易受强酸或强碱溶液的破坏,且实验中 4 种糖蛋 白均没有确定的等电点,除 HRP 外,其余 3 种蛋白 呈现出5 ~ 8 的等电点范围,因此,考察了中性 pH 缓冲液( pH 7. 4、 7. 8、 8. 2、 8. 7) 的影响。图 4 的结 果表明, pH 7. 4 时, 4 种糖蛋白的响应值最低,糖蛋 白 B-Thr 和 PHA 的多峰间分离度也最差;而 pH 8. 7 时, 4 种糖蛋白的出峰较好, B-Thr 以及 PHA 的多峰 得到很好分离,成分单一的 H-Thr 以及 HRP 峰形较 好,且响应值较高。pH 7. 8 和 8. 2 的结果介于二者 之间。因此后续实验选用 pH 8. 7 的硼酸盐缓冲液。 分离电压的选择 由图 4 可见, 4 种糖蛋白中 除 HRP 外,其余3 种糖蛋白的峰形明显较差。为此 考察了电压对分离的影响。对 H-Thr、HRP 以及 PHA 选择了 -15,- 20,- 25 kV 3 个电压。因 BThr 出峰数较多,为增加其分辨率,选择了较低的 -10,-15,-20 kV 3 个电压。在 - 25 kV 电压下,蛋白质样品的迁移时间明显较快,有利于单一峰 形蛋白质的快速分析( 见图 5 中 HRP 和 H-Thr) 。 但对含有多峰的 PHA 和 B-Thr 蛋白,随着电压的升 高,多峰间的分辨率明显降低( 见图 5 中 PHA 和 BThr) 。此外,高电压下电泳速度加快的同时,蛋白质 样品的检测灵敏度有所降低。在 -20 kV 分离时, H-Thr、 HRP 以及 PHA 的分离效果较好,但 B-Thr 的 多峰之间不能有效分离。而在 -10 kV 时, B-Thr 多 峰间的分离得到改善。因此,后续表征蛋白质稳定 性时,对 H-Thr,HRP 以及 PHA 选择 -20 kV 电压, 而对 B-Thr 选择 -10 kV 电压。

2. 2. 4 糖蛋白的稳定性

将0. 2 mol/L( pH 7. 4) 硼酸盐缓冲液配制的蛋 白质样品分为3 份,分别置于 20 ℃、 4 ℃和 -20 ℃ 下放置不同时间。比较样品的电泳图变化,图 6 的 结果显示, 48 h 内, 3 种保存温度下, 4 种糖蛋白溶 液的电泳图没有明显改变,说明样品溶液稳定性良 好。当样品保存时间大于一周且小于四周,随着时 间的增加, 3 种温度对样品的稳定性存在明显影响: 在 -20 ℃保存时, 4 种糖蛋白电泳图相对稳定,峰 形、出峰个数随时间变化基本不变; 在 4 ℃保存时, H-Thr 的峰形变化较大,难以确定其峰高或峰面积, 但其余3 种糖蛋白的电泳图基本不变,受保存时间影响不大;在20 ℃保存时,除 HRP 仍基本保持稳定 外,其余3 种糖蛋白的电泳图均出现明显变化: HThr 的峰高明显降低,糖蛋白 B-Thr 和 PHA 的峰形 和峰位置随时间增加而改变,一些峰降低或消失,但 又有新形态的峰出现。放置时间大于两周且小于四 周, HRP 仍保持相对稳定,而 H-Thr 的峰几乎消失; PHA 和 B-Thr 的出峰数、峰高及迁移时间与新配样 品相比,也出现显著的变化。

3 结论

多肽和蛋白质等生物样品的稳定性对后续实验 研究非常重要。为了保证对多肽和蛋白质等样品的 定量分析,对其进行高效、快速的稳定性考察和表征 非常必要。本文所用的 Ang II 和4 种糖蛋白的稳定 性均较好,配制的样品溶液在48 h 内可保持稳定。 毛细管电泳方法具有高效、快速、低成本优势,适合 用于快速表征和评价多肽和蛋白质样品的稳定性, 以及研究影响稳定性的关键因素,且特别适合价格 昂贵或来源稀少的生物样品的表征和评价。

相关文章