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血清蛋白电泳的比例模型诊断肝纤维化程度的研究

[导读]无论诊断显著肝纤维化、严重肝纤维化或肝硬化,基于 SPE 的比例模型的诊断价值均不优于 γ-球蛋白含量构成比。

开发新指标、探讨新方法和基于病因的个体化诊 断是目前肝纤维化程度无创诊断研究的热点。蛋白组和代谢组学方法和技术已被用于血浆新指标的筛选和新模型的建立,功能形态学成像和分子影像学检查也已被用于临床评价,但远不能满足让患者避免有创检查的需求。肝纤维化程度无创诊断的研究主要集中于丙型肝炎[1],但衍生于丙型肝炎相关肝纤维化程度的无创诊断指标或模型不一定适合于乙型肝炎,而且至今尚未找到合适的乙型肝炎相关肝纤维化程度的无创诊断指标、模型和方法[2-4]。

作为一种操作简单、经济实用的生化指标,血清蛋白电泳( serum protein electrophoreses,SPE) 已广泛用于多种疾病的筛检和诊断; 在肝病领域,SPE 主要用于各种原因所致肝硬化的辅助诊断,但很少有基于肝组织病理学对照的研究文献,也很少有用于肝纤维化程度无创诊断的研究报告[5-7]。本文就 189 例慢性乙型肝炎患者 SPE 检查的结果,通过 SPE 各组分含量构成比与肝组织病理学分期的相关分析,构建比例模型,进一步探讨 SPE 诊断肝纤维化程度的价值。

1 资料与方法

1. 1 研究对象 慢性乙型肝炎189 例,均为2009 年1月 ~ 2010 年 6 月上海市( 复旦大学附属) 公共卫生临床中心住院患者。诊断符合 2005 年中华医学会肝病学分会与感染病学分会联合制订的慢性乙型肝炎指南中的标准。合并其他病毒性肝炎、自身免疫性肝病、药物性肝病、遗传性肝病、血吸虫性肝病的患者被排除。所有患者均无失代偿性肝病的临床表现和实验室依据,并且无妊娠、肾脏疾病、血液系统疾病,近 3 个月内无输血或血制品史。189 例患者中,男 137 例,女 52例,男∶ 女 = 2. 63 ∶ 1; 年龄 7 ~ 72 岁,平均( 37. 50 ±10. 41) 岁。

1. 2 研究资料 肝组织活检采用 1s 经皮肝穿刺法,标本采集后立即置塑料标本管内冰冻送检。肝组织置塑料包埋盒中,进行中性甲醛固定、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡浸入和包埋、切片,苏木素-伊红染色和网状纤维染色。用光学显微镜多视野观察进行组织病理学分级( grading,G) 和分期( staging,S) ,肝组织病理学诊断参照 2000 年西安全国病毒性肝炎及肝病学术会议修订的标准。病理学分级包括 G0、G1、G2、G3、G4 5 级,分期包括 S0、S1、S2、S3、S4 5 期; 其中病理学分期 < S2( S0、S1) 、≥S2( S2、S3、S4) 、≥S3( S3、S4) 和= S4 分别被称为非显著肝纤维化、显著肝纤维化、严重肝纤维化和肝硬化。

所有患者于肝穿刺前后 1 周内早晨空腹采集静脉血,分离血清。SPE 采用法国 Sebia 公司生产的 Hydrasys全自动电泳仪及其配套试剂检测,用配套的全自动扫描分析仪进行 SPE 图谱扫描和数据分析。

1. 3 研究方法 统计分析和数据处理采用 SPSS 13. 0和 Microsoft excel 2007。SPE 各组分含量构成比与肝组织病理学分期之间的相关性采用 Spearman 等级相关分析。根据相关分析,SPE 各组分被分成两组,P 组包括 NP 个组分 Pα,其含量构成比与肝组织病理学分期呈正相关( 1≤α≤NP ) ; N 组包括 NN 个组分 Nβ,其含量构成比与肝组织病理学分期呈负相关( 1≤β≤NN) 。建立分数函数 F = ∑( ∑Pα /∑Nβ ) ,即基于 SPE诊断肝纤维化程度的比例模型; 式中∑Pα 是部分 Pα的总和,∑Nβ 是部分 Nβ 的总和。根据组合原理,n 个组分部分组合的数量 = 2n-1,因此,分数函数 F = ∑( ∑Pα /∑Nβ ) 的数量 = ( 2NP-1) × ( 2NN-1) 。

SPE 各组分含量构成比和基于 SPE 的比例模型诊断肝纤维化程度的评价采用 ROC 曲线法。以 SPE各组分含量构成比和各比例模型作为测试变量,以肝纤维化程度作为状态变量,绘制 ROC 曲线。依据 ROC曲线下面积评价测试变量的诊断价值分为 3 级: 低度:ROC 曲线下面积 < 0. 70,中度: ROC 曲线下面积 =0. 70 ~ 0. 90,高度: ROC 曲线下面积 > 0. 90。

比较 SPE 各组分含量构成比和各比例模型诊断肝纤维化程度的 ROC 曲线下面积,筛选诊断肝纤维化程度的最佳 SPE 组分含量构成比和比例模型。理论上,SPE 各组分含量构成比与各比例模型诊断某种程度肝纤维化的 ROC 曲线下面积之间的比较将产生 5× ( 2NP-1) × ( 2 NN -1) 个配对; 实际上,本文只选择 SPE组分含量构成比诊断某种程度肝纤维化的最大 ROC曲线下面积与比例模型诊断某种程度肝纤维化的前 5大 ROC 曲线下面积进行比较。ROC 曲线下面积之间的差异比较采用 U 检验。

2 结果

2. 1 SPE 各组分含量构成比与肝组织病理学分期之间的相关性 血清白蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白含量构成比与肝组织病理学分期呈显著负相关,α1-球蛋白、γ-球蛋白含量构成比与肝组织病理学分期呈显著正相关( 见表 1) 。

2. 2 SPE 各组分含量构成比和基于 SPE 的比例模型诊断显著肝纤维化的 ROC 曲线下面积

2. 2. 1 SPE 各组分含量构成比诊断显著肝纤维化的ROC 曲线下面积: 除 β-球蛋白外,其他各组分含量构成比均有诊断显著肝纤维化的价值( P < 0. 05) ,但其诊断价值均为低度; 其中 ROC 曲线下面积最大的组分为 γ-球蛋白( 见表 2) 。

2. 2. 2 基于 SPE 的比例模型诊断显著肝纤维化的ROC 曲线下面积: 所有比例模型均有诊断显著肝纤维化的价值( P < 0. 05) ,但其诊断价值均为低度; 其中ROC 曲线下面积由大到小的前 5 个模型依次为 α1-球蛋白/( α2-球蛋白 + β-球蛋白) 、α1-球蛋白/α2-球蛋白、( α1-球蛋白 + γ-球蛋白) /α2-球蛋白、α1-球蛋白/β-球蛋白、γ-球蛋白 /α2-球蛋白( 见表 3) 。

2. 2. 3 基于 SPE 的部分比例模型与血清 γ-球蛋白含量构成比诊断显著肝纤维化的 ROC 曲线下面积之间的比较: α1-球蛋白/( α2-球蛋白 + β-球蛋白) 、α1-球蛋白/α2-球蛋白、( α1-球蛋白 + γ-球蛋白) /α2-球蛋白、α1-球蛋白/β-球蛋白、γ-球蛋白/α2-球蛋白诊断显著肝纤维化的 ROC 曲线下面积与血清 γ-球蛋白含量构成比诊断显著肝纤维化的 ROC 曲线下面积相比,均无显著性差异( P > 0. 05,见表 4) 。

2. 3 SPE 各组分含量构成比和基于 SPE 的比例模型诊断严重肝纤维化的 ROC 曲线下面积

2. 3. 1 SPE 各组分含量构成比诊断严重肝纤维化的ROC 曲线下面积: 除 β-球蛋白外,其他各组分含量构成比均有诊断严重肝纤维化的价值( P < 0. 05) ,但只有γ-球蛋白含量构成比的诊断价值达到了中度( 见表 5) 。

2. 3. 2 基于 SPE 的比例模型诊断严重肝纤维化的 ROC曲线下面积: 所有比例模型均有诊断严重肝纤维化的价值( P <0. 05) ,其中 12 个比例模型的诊断价值达到了中度; 其中 ROC 曲线下面积由大到小的前 5 个模型依次为( α1-球蛋白 + γ-球蛋白) /α2-球蛋白、( α1-球蛋白 +γ-球蛋白) /( 白蛋白 + α2-球蛋白) 、( α1-球蛋白 + γ-球蛋白) /( 白蛋白 + α2-球蛋白 + β-球蛋白) 、γ-球蛋白/( 白蛋白 + α2-球蛋白) 、γ-球蛋白/α2-球蛋白( 见表 6) 。

2. 3. 3 基于 SPE 的部分比例模型与血清 γ-球蛋白含量构成比诊断严重肝纤维化的 ROC 曲线下面积之间的比较: ( α1-球蛋白 + γ-球蛋白) /α2-球蛋白、( α1-球蛋白 +γ-球蛋白) /( 白蛋白 + α2-球蛋白) 、( α1-球蛋白 + γ-球蛋白) /( 白蛋白 + α2-球蛋白 + β-球蛋白) 、γ-球蛋白/( 白蛋白 + α2-球蛋白) 、γ-球蛋白/α2-球蛋白诊断严重肝纤维化的 ROC 曲线下面积与血清 γ-球蛋白含量构成比诊断严重肝纤维化的 ROC 曲线下面积相比,均无显著性差异( P >0. 05,见表 7) 。

2. 4 SPE 各组分含量构成比和基于 SPE 的比例模型诊断肝硬化的 ROC 曲线下面积

2. 4. 1 SPE 各组分含量构成比诊断肝硬化的 ROC 曲线下面积: SPE 各组分含量构成比均有诊断肝硬化的价值( P < 0. 05) ,其中 γ-球蛋白、白蛋白含量构成比的诊断价值达到了中度( 见表 8) 。

2. 4. 2 基于 SPE 的比例模型诊断肝硬化的 ROC 曲线下面积: 所有比例模型均有诊断肝硬化的价值( P <0. 05) ,并且所有比例模型的诊断价值达到了中度; 其中ROC 曲线下面积由大到小的前 5 个模型依次为( α1-球蛋白 + γ-球蛋白) /α2-球蛋白、γ-球蛋白/α2-球蛋白、γ-球蛋白/( 白蛋白 + α2-球蛋白 + β-球蛋白) 、( α1-球蛋白+ γ-球蛋白) /( 白蛋白 + α2-球蛋白) 、( α1-球蛋白 + γ-球蛋白) /( 白蛋白 + α2-球蛋白 + β-球蛋白) ( 见表 9) 。

2. 4. 3 基于 SPE 的部分比例模型与血清 γ-球蛋白含量构成比诊断肝硬化的 ROC 曲线下面积之间的比较:( α1-球蛋白 + γ-球蛋白) /α2-球蛋白、γ-球蛋白/α2-球蛋白、γ-球蛋白/( 白蛋白 + α2-球蛋白 + β-球蛋白) 、( α1-球蛋白 + γ-球蛋白) /( 白蛋白 + α2-球蛋白) 、( α1-球蛋白 + γ-球蛋白) /( 白蛋白 + α2-球蛋白 + β-球蛋白)诊断肝硬化的 ROC 曲线下面积与血清 γ-球蛋白含量构成比诊断肝硬化的 ROC 曲线下面积相比,均无显著性差异( P >0. 05,见表 10) 。

3 讨论

SPE 用于肝硬化的辅助诊断已超过半个世纪[8],但很少有文献参照病理学诊断探讨其诊断肝硬化的价值,也很少有研究描述 SPE 是否可用于肝纤维化程度的诊断及其诊断肝纤维化程度的价值[5-7]。最近,陈乐无等[9]分析了 SPE 各组分含量构成比在慢性乙型肝炎不同肝组织病理学分期患者之间的差异,结果显示,血清白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白含量构成比在 S4 与 S1、S2 之间与存在显著性差异,血清白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、γ-球蛋白含量构成比在 S3 与 S1、S2 之间存在显著性差异。提示血清蛋白各组分含量构成比对乙型肝炎相关肝纤维化程度可能有诊断意义。

本文结果显示,慢性乙型肝炎患者中,血清白蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白含量构成比与肝组织病理学分期呈显著负相关,α1-球蛋白、γ-球蛋白含量构成比与肝组织病理学分期呈显著正相关。提示随着肝纤维化程度的升高,血清白蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白含量构成比逐步下降,α1-球蛋白、γ-球蛋白含量构成比逐步上升; 血清白蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白含量构成比下降和 α1-球蛋白、γ-球蛋白含量构成比上升可能对乙型肝炎相关的肝纤维化程度有诊断价值。本文采用ROC 曲线下面积对 SPE 诊断肝纤维化程度价值进行了初步评价。结果指出,除 β-球蛋白外,SPE 其他组分含量构成比均有诊断显著肝纤维化、严重肝纤维化的价值,但只有 γ-球蛋白含量构成比诊断严重肝纤维化的价值达到了中度; 虽然 SPE 各组分含量构成比均有诊断肝硬化的价值,但只有 γ-球蛋白、白蛋白含量构成比的价值达到了中度。

SPE 的 5 个组分中,只有白蛋白成分相对单一,α1-球蛋白主要由 α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白、转甲状腺素蛋白、转皮质激素蛋白组成,α2-球蛋白主要由 α2-巨球蛋白、铜蓝蛋白和触珠蛋白组成,β-球蛋白主要由转铁蛋白、β-脂蛋白、补体 C3 和少量免疫球蛋白( IgA,IgG) 组成,γ-球蛋白主要由免疫球蛋白( IgG,IgM) 组成。除免疫球蛋白外,绝大部分血浆蛋白质由肝脏合成; 急性期反应蛋白多数属于 α1-球蛋白和 α2-球蛋白组分,部分属于 β-球蛋白组分。在感染、炎症、肿瘤状态下,白蛋白合成减少,α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白中的主要成分合成增加,γ-球蛋白合成增加;在肝脏储备功能下降的情况下,白蛋白合成减少,α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白中的主要成分合成减少,γ-球蛋白合成增加。就对血清蛋白质浓度及其构成比的影响而言,慢性乙型肝炎及其后果如肝硬化、肝细胞癌和失代偿肝病是一组特殊疾病,表现为随着肝脏炎症活动度、纤维化程度的升高和肝脏储备功能的下降,血清白蛋白浓度及其构成比逐步下降,γ-球蛋白浓度及其构成比逐步上升,而 α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白浓度及其构成比的走向不稳定。随着慢性肝炎疾病程度或肝脏炎症活动度和/或纤维化程度的升高,血清 α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白浓度及其构成比的走向,不同的研究报道的结果不完全一致[10-12]。

为挖掘 SPE 诊断肝纤维化程度的潜能,本文通过建立分数函数构建了诊断肝纤维化程度的比例模型,并采用 ROC 曲线法对基于 SPE 的比例模型诊断肝纤维化程度的价值进行了初步评价。结果显示,所有比例模型均有诊断显著肝纤维化的价值,但其诊断价值均为低度; 所有比例模型均有诊断严重肝纤维化的价值,其中 12 个比例模型的诊断价值达到了中度,所有比例模型均有诊断肝硬化的价值,并且所有比例模型的诊断价值达到了中度。为筛选最具诊断意义的比例模型,本文对诊断肝纤维化程度的 ROC 曲线下面积最大的 5 个比例模型的 ROC 曲线下面积与诊断肝纤维化程度的 ROC 曲线下面积最大的 SPE 组分含量构成比即 γ-球蛋白含量构成比的 ROC 曲线下面积进行比较,结果指出,无论诊断显著肝纤维化、严重肝纤维化或肝硬化,基于 SPE 的比例模型的诊断价值均不优于γ-球蛋白含量构成比。

本文结果提示,基于 SPE 的各组分中,血清白蛋白和 γ-球蛋白含量构成比对乙型肝炎相关肝纤维化程度有一定诊断价值; 与单纯 SPE 各组分相比,基于SPE 的比例模型诊断肝纤维化程度的价值有所提升,但未能筛选出比 γ-球蛋白含量构成比诊断价值更大的模型。因此,有必要采取蛋白组学方法筛选更多的诊断肝纤维化程度的成分单一的指标,通过评价单项指标或多项指标构建的模型进一步提升肝纤维化程度的无创诊断水平。

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