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尿蛋白电泳检测

[导读]肾小管损伤在早期 DN 中占有相当比例,使用尿蛋 白电泳结合尿 mAlb 检测可减少早期 DN 肾小管性蛋白尿漏检。

糖尿病肾病 ( diabetic nephropathy, DN) 是糖 尿病( diabetes mellitus, DM) 全身微血管并发症之 一,也是导致慢性肾衰竭的主要原因之一。糖尿 病患者定期筛查可发现早期 DN,通过适当治疗 常可逆转早期病变。因此,DN 的筛查引起了临 床的重视[1]。目前临床应用较多的早期 DN 诊断指标是尿微量白蛋白( microalbumin, mAlb) ,后者 出现提示肾小球早期损害。然而,近来研究显示 早期 DN 的肾小管损伤独立于肾小球[23],其出现 甚至可能早于肾小球。那么代表肾小管重吸收障 碍的肾小管性蛋白尿在早期 DN 的出现情况如何 呢? 我们使用单次测定可反映蛋白谱全貌的尿蛋白电泳法加以探讨,考虑到尿蛋白电泳的检出限 ( 15 mg/L) ,我们对 DM 伴随微量和极微量白蛋 白尿( 15 ~300 mg/24 h) 的患者进行分析,观察早 期 DN 肾小管性蛋白尿的出现情况。

材料和方法

一、对象 对襄阳市中心医院门诊2 型 DM 患者进行尿 mAlb 测定,选择结果为 15 ~300 mg/24 h 的患者 48 例进行尿蛋白电泳分析,其中男 20 例、女 28 例,年龄 46 ~ 77 岁,患者 DM 病史平均为 6 年且 均无临床 DN 史。正常对照组 10 名,均为无 DN 史和肾病史的正常体检者,年龄 48 ~76 岁。 二、仪器与试剂 法国 Sebia 公司 HYDRASYS 全自动电泳仪 及配套尿蛋白电泳试剂盒; 科大创新 GC911 γ 放 射免疫计数器及维坊三维公司尿白蛋白放射免疫 分析试剂盒。糖化血红蛋白测定使用伯乐 D10 高效液相色谱分析仪和配套试剂,尿常规干化学 法分析使用长春迪瑞 H500 尿液分析仪和 H10Ⅱ试纸条。 三、方法 留取 24 h 尿,使用 GC911γ 放射免疫计数器 测定尿 mAlb 浓度,经换算得 24 h 尿 mAlb 含量。 选择 mAlb 含量为 15 ~ 300 mg/24 h 的病例进行 尿蛋白电泳。具体步骤: 将 20 μL 十二烷基磺酸 钠与 80 μL 尿标本混匀后取 5 μL 点样于凝胶孔 中, 经 HYDRASYS 全自动电泳仪( 20 ℃、 225 V、 44 mA) 电泳30 min ,胶片取出后置染色槽内自动 烘干、染色、脱色、固定,最后进行扫描分析。以尿 蛋白电泳显示的蛋白尿类型进行分组比较,并以 尿 mAlb 30 mg/24 h 为界分 2 组观察尿蛋白电泳 结果。同时记录患者糖化血红蛋白( HbA1c) 、尿 糖、尿隐血等相关资料。正常对照组同时进行尿 蛋白电泳。 尿蛋白电泳结果判断标准: ( 1) 肾小管性蛋 白尿,主要为低分子量蛋白条带,包括 β2-微球蛋 白、 α1-微球蛋白、视黄醇结合蛋白、游离轻链等, 含量较均一,而白蛋白比例不超过总蛋白的 40%;( 2) 单纯白蛋白性肾小球性蛋白尿,仅见浅 染的均一白蛋白条带; ( 3) 选择性肾小球性蛋白尿,以白蛋白条带为主,伴随少量大分子蛋白成份 和微量的小分子蛋白成份,其中大分子蛋白/白蛋 白 <0. 2。见图 1。

四、统计学方法 采用 SPSS 13. 0 软件进行统计分析。实验数 据以 珋 x ± s 表示。各组间尿蛋白扫描百分比结果 比较采用方差分析。对肾小管性尿蛋白百分比与 HbA1c、尿隐血、尿糖结果之间进行相关性分析。 P <0. 05 表示差异有统计学意义。

结 果

一、尿蛋白电泳扫描分析与 24 h 尿 mAlb 定 量结果 以尿蛋白电泳结果分组, 48 例 2 型糖尿病患 者中表现为低分子蛋白为主的肾小管性蛋白尿 8 例( 17%) ,以中、高分子蛋白为主的肾小球性蛋 白尿有 36 例( 75%) [包括单纯白蛋白性肾小球 性蛋白尿 32 例( 67%) 、选择性肾小球性蛋白尿 4 例( 8%) ],未检出尿蛋白条带4 例( 8%) 。各组 间尿蛋白扫描百分比比较差异有统计学意义( P < 0.05) 。各组尿蛋白电泳扫描结果及尿 mAlb 定量 结果见表1。正常对照组均未检出尿蛋白条带。 以 mAlb 定量结果分组,>30 ~300 mg/24 h 和 15 ~ 30 mg/24 h 的患者分别归为 mAlb 尿组( 38 例) 和极微量白蛋白尿组( 10 例) 。38 例 mAlb 尿 组标本经尿蛋白电泳均显示有尿蛋白条带,其中肾

小管性蛋白尿 6 例( 16%) 、肾小球性蛋白尿 32 例 ( 84%) [包括单纯白蛋白性肾小球性蛋白尿28 例 ( 74%) 、选择性肾小球性蛋白尿 4 例( 11%) ]。10 例极微量白蛋白尿组经尿蛋白电泳有6 例显示有 尿蛋白条带( 60%) [包括肾小管性蛋白尿 2 例 ( 20%) 、单纯白蛋白性肾小球性蛋白尿4 例 ( 40%) ], 4 例( 40%) 未检出尿蛋白条带。

二、 2 型 DM 患者实验室相关资料分析 48 例 2 型 DM 患者肾小管性尿蛋白百分比、 尿蛋白干化学定性、尿隐血、尿糖及 HbA1c结果见 表 2。肾小管性尿蛋白百分比与 HbA1c 异常( > 6. 5%) 呈正相关( r = 0. 300) 。与尿隐血、尿糖未 见明显相关性。

讨 论

由于近年来对早期 DN 发病机制的研究多集 中于肾小球病变[4],临床广泛使用的早期 DN 筛 查指标为代表肾小球损伤的尿 mAlb 检测。本研 究结果显示,在 mAlb 结果为 > 30 ~ 300 mg/24 h 的 mAlb 尿组中有 38 例经尿蛋白电泳均显示有 蛋白条带,其中 84%为以白蛋白为主的肾小球性 蛋白尿,提示肾小球仍是早期 DN 肾损伤的主要 部位,使用 mAlb 筛查可发现大部分早期 DN 患 者。然而,在 mAlb 结果为 15 ~ 30 mg/24 h 的极 微量白蛋白尿组中有2 例为肾小管性蛋白尿。考 虑到白蛋白在肾小管性蛋白尿中所占的比例( ≤ 40%) ,肾小管性尿蛋白的排出并未能通过 mAlb 检测灵敏地反映出。这不仅显示在达到早期 DNA诊断标准之前小部分患者即开始有肾小管病变, 也提示以 mAlb >30 ~300 mg/24 h 作为早期 DN 监测标准对肾小管性蛋白尿存在漏检的可能 ( 25%, 2/8) 。 本研究结果显示,肾小管性蛋白尿在检出尿 蛋白条带的患者中占18%( 8/44) ,提示肾小管病 变在 DN 发病早期的作用不容忽视。此时伴随的 尿 mAlb 定量多位于正常或轻度异常范围[( 119 ±91) mg/24 h,其中 2 例≤30 mg/24 h],提示肾 小管病变可能独立于肾小球病变,其发生甚至可 能早于肾小球病变,这与 Thomas 等[3]对肾超微 结构的研究结果相符。检测原理为针对白蛋白的 干化学法尿蛋白定性试验检测肾小管性蛋白尿 时,其结果亦为阴性( 5/8) 和弱阳性( 3/8) 。这种 位于正常或轻度异常范围的结果常不足以引起临

床的充分重视,从而可能错过早期对症治疗的时 机。因此,对早期 DN 的筛查有必要在尿 mAlb 之 外,增加对肾小管性尿蛋白的早期检测。本研究 肾小管性蛋白尿多伴随 HbA1c异常。持续高血糖 状态下患者体内氧自由基产生过多,同时糖进入 肾近曲小管细胞并不依赖胰岛素使近曲小管对慢 性高血糖的有害作用更敏感[2]。提示合理调控 血糖可能是减少早期 DN 肾小管损伤的重要措施 之一。本研究病例中未发现非选择性肾小球性蛋 白尿和混合性蛋白尿。可能这 2 类蛋白尿多见于 DN 的中晚期,同时结果可能受病例数和前期病 例筛选的限制,其在早期 DN 的出现情况还有待 于进一步观察。 限于检测灵敏度和受尿液离子基质等的影 响,肾小管性尿蛋白在轻度异常范围内很难通过 24 h尿微量总蛋白测定( 染料结合法或比浊 法)[5]检测出; 而目前普遍用于早期 DN 筛选的 24 h 尿 mAlb 测定( 放射免疫法) 对肾小管性尿蛋 白成份亦不具有特异性,只能在尿总蛋白排出量 增大、尿白蛋白≥30 mg/24 h 时才能引起临床关 注; 尿液特定蛋白测定( 免疫比浊法) 虽能特异分 析肾小管性尿蛋白,但单项测定均有各自局限性 而多项联合测定费用较高。同时,上述测定均未 能反映尿蛋白谱全貌,可弥补这项不足的是尿蛋 白电泳法[67] 。与肾活检相比,尿蛋白电泳可在无 损伤的情况下协助临床判断肾病变的部位和程 度。尿蛋白经电泳后以分子量不同而显带,中、高 分子量蛋白主要反映肾小球病变,而低分子量蛋 白代表肾小管和间质损害或溢出性改变。其中溢 出性蛋白尿仅在小分子区出现少量深染条带,而 肾小管性蛋白尿主要表现为多条低分子条带较为 均匀出现,同时白蛋白比例不超过总蛋白的 40%。这种多条带综合分析在早期 DN 肾小管性 蛋白尿的监测中尤显优势。 以往研究[89]多集中于对已确诊为 DN 的患 者进尿蛋白电泳分析,而本研究的研究对象为无 临床 DN 病史的 DM 患者。通过尿蛋白电泳分 析,结果显示在排出微量和极微量白蛋白尿的 DM 患者中肾小管性蛋白尿占有相当比例 ( 17%) 。此类以肾小管损害为主的早期 DN 应引 起临床重视。不同于前期文献[910]使用尿蛋白定

性法进行对比分析,本研究选择了敏感度较高的 尿 mAlb 定量法过筛病例并观察尿蛋白电泳模 式。结果显示在 mAlb 排出量仅 15 ~ 30 mg/24 h 的病例中,通过尿蛋白电泳法尚可检出肾小管性 蛋白尿 2 例,可见尿蛋白电泳结合 mAlb 检测可 提高早期 DN 的检出。 总之,肾小管损伤在早期 DN 中占有相当比 例,使用尿蛋白电泳结合尿 mAlb 检测可减少早 期 DN 肾小管性蛋白尿的漏检

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